根瘤菌诱导植物耐盐的基因表达谱及相关分子机制研究

根瘤菌诱导植物耐盐的基因表达谱及相关分子机制研究

2018-04-14 16:33:03 107

根瘤菌诱导植物耐盐的基因表达谱及相关分子机制研究

研究背景

在植物生长的环境中,有一类可以有利于植物生长的微生物被称为根瘤菌(Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR),它可以通过各种直接或者间接的途径促进植物生长,如抵抗病原菌、产生植物激素、释放挥发性物质、产生植物酸和铁元素从而改善土壤中矿物质成分等。一些研究显示,某些PGPR可以参与植物抵抗盐胁迫。因此,人们开始尝试用PGPR来增强植物对胁迫的耐受力。最近的研究显示,一些PGPR可以提高许多农业作物的耐盐能力,如Azospirillum, Pseudomonas 等。同时,人们开始研究植物和PGPR的互作,已有的报道主要关注在互作过程中植物的各种生理变化,而关于PGPR诱导植物耐盐的基因表达谱及相关分子机制还没有相关报道。中科院寒旱所王若愚研究员课题组在研究中选取了Bacillus amyloliquefaciens FZB42来研究PGPR介导的植物耐盐的基因表达谱。FZB42是从莴苣根部土壤中分离出来的,在商业上被广泛应用于许多重要经济物质的种植。最近,许多研究显示FZB42具有促进植物生长和生物防除的活性(如抵抗盐胁迫)。但是,FZB42介导的植物抵御盐胁迫的分子机制仍不清楚。本研究通过转录组测序技术,鉴定在盐胁迫下FZB42与拟南芥共生时植物响应表达的重要基因,从而揭示相关的分子机制。LUYOR-3260便携式荧光蛋白激发光源能够方便快捷激发植入到动植物体内的荧光蛋白发出荧光。

 

材料与方法
1、实验材料:两组拟南芥材料,一组与FZB42共生长,一组为对照(无FZB42);分别进行两组处理,一组为0mM NaCl,组为100mM NaCl,处理7天后取地上部分小苗的芽提取RNA,每一组设置3个生物学重复,共12个样品。

2、测序方法:转录组测序,测序平台为北京百迈客生物科技有限公司Illumina HiSeq 2000。

研究结果
1、表型分析:有无盐胁迫条件下,FZB42均可促进拟南芥生长
为了确认FZB42对植物耐盐的影响,在100mM NaCl和0mM NaCl下,观察有无FZB42(处理和对照组)时拟南芥的生长情况。处理10天后,通过测定植物芽的鲜重和干重评估小苗的生物量变化。结果显示,相对没有FZB42,与FZB42共生长的植物鲜重在对照组和处理组分别增加了31.2%和24.7%,干重也增加了28.3%和27.2%。这说明无论是否在盐胁迫条件下,FZB42均可促进植物生长。为了进一步分析盐胁迫下FZB42与拟南芥共生时植物响应表达的重要基因,对以上4组材料分别进行转录组测序。
2、差异基因KEGG分析

 依据转录组基因表达数据,筛选了4组材料间的差异表达基因(DEGs)。相对对照组,有FZB的处理组在0和100 mM NaCl分别有1461个和1288个DEGs,其中在0 mM时有953个上调和508个下调,在100 mM时有1024个上调和264个下调。其中在0 mM有794个基因是特异性差异表达,100 mM有621个特异表达的DEGs。为了进一步分析DEGs的生物学功能,对其进行KEGG数据库注释和富集分析。在0 mM和100 mM NaCl的DEGs分别显著富集到5和6个pathways。其中4个pathways(类苯丙烷生物合成、苯丙氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、植物-病原菌互作)在0 mM和100 mM NaCl中都显著富集。
3、MapMan整合分析DEGs在代谢通路中的功能

 用MapMan整合和直观地观察在代谢通路中DEGs的功能。分析结果显示,FZB42诱导表达的植物基因主要与以下代谢途径相关:能量代谢、碳水化合物代谢、激素代谢、氧化还原反应、转录因子、胁迫响应。

 在能量代谢方面,相对0 mM,在100 mM NaCl中光合作用和ATP合成途径中相关基因上调表达。这暗示FZB42在盐胁迫条件下促进植物产生更多能量。同时,氨基酸生物合成和降解、海藻糖代谢相关的pathways也是受到FZB42诱导表达的,如脯氨酸合成的关键酶P5CS1。当植物响应非生物胁迫时常常在细胞中积累脯氨酸。在盐胁迫条件下,FZB42可诱导植物中P5CS1上调表达,从而协助植物抵御盐胁迫。LUYOR-3415RG便携式荧光蛋白激发光源能够方便快捷激发植入到动植物体内的荧光蛋白发出荧光,双波长激发,无需荧光显微镜,就能快速观察到GFP、RFP的荧光。

在生长发育方面,在100 mM NaCl中遗传物质复制和合成相关基因上调表达,如核酸酶、DNA合成、RNA合成等。在有FZB共培养的0 mM和100 mM NaCl中,植物生长相关生物学过程的一些基因都上调表达,如延展蛋白、细胞壁修饰酶等。此外,与细胞周期、细胞分裂相关的3个基因在FZB共培养的100 mM NaCl中上调表达,另外4个基因在0 mM中上调表达。细胞壁修饰、细胞分裂相关蛋白表达水平改变有利于细胞发育和分裂,植物从而生长更加旺盛。

 在胁迫响应方面,分析比较了在有FZB共培养的0 mM和100 mM NaCl中植物生物胁迫和非生物胁迫相关的DEGs。分析结果显示,相对盐胁迫条件下(100 mM NaCl),在0 mM时更多的基因差异表达。其中20个编码PR蛋白的基因在100 mM上调表达,36个PR基因在0 mM时诱导表达。冷害相关的5个响应基因在有FZB42时均诱导表达,3个干旱和盐胁迫相关的基因在0 mM时上调表达。此外,还有一些热激蛋白、ROS相关酶均在有FZB42时均诱导表达。

 在激素方面,在有FZB共培养的0 mM和100 mM NaCl中,植物激素JA、ET、ABA、auxin、SA和BR相关基因均差异表达。如,JA合成相关基因和响应相关基因均在FZB42时上调表达;乙烯生物合成相关基因(如ACC合成酶)在有FZB共培养的100 mM NaCl中也上调表达;编码ABA生物合成途径关键酶的NCED基因下调表达。

 在转录因子方面,在有FZB共培养的0 mM和100 mM NaCl中,分别有58个和49个转录因子(TFs)差异表达。其中包括一些在响应非生物胁迫中发挥重要作用的转录因子家族,如MYB、WRKY、bZIP、AP2/EREBP、和bHLH。


转录组数据的实验验证
(1)盐胁迫条件下FZB42影响Na+、K+和Ca2+平衡

在光合作用和能量转化过程中,Na+、K+和Ca2+含量非常重要。因此,检测了在盐胁迫条件下这三种金属离子的含量。相对无FZB42的对照,在有FZB42共培养的0 mM和100 mM NaCl中,这三种金属离子的含量都发生了较大的变化。其中,100 mM NaCl中钠离子含量下降了16.4%,这说明在盐胁迫条件下FZB42会减少钠离子的积累。这结果也与之前转录组数据分析结果相吻合,编码Na+/H+逆向转运的基因在转录组数据中均表现出负调控的模式。

(2)脯氨酸的积累

转录组分析显示,在盐胁迫条件下FZB42可诱导脯氨酸合成的关键酶P5CS1上调表达。通过测定4组实验材料芽中脯氨酸含量,发现在有FZB共培养的盐胁迫条件下,植物中积累的脯氨酸含量增加了32%。
(3)激素相关突变体表型分析

转录组分析显示,乙烯响应的15个转录因子在FZB42共培养的盐胁迫条件下差异表达。为了验证乙烯在FZB诱导植物耐盐中的作用,选取了乙烯相关突变体etr1-3(乙烯信号转导缺陷突变体)和eto1(乙烯过量积累突变体)进行盐胁迫相关表型分析。在0 mM和100 mM NaCl中,FZB42均不能促进突变体etr1-3和eto1生长。这说明乙烯信号途径对于FZB42参与促进植物生长是必须的。此外,还用JA、ABA相关突变体的表型分析也验证了转录组的数据分析结果。

(4)qRT-PCR实验验证

为了验证转录组数据的结果,选取了35个DEGs(19个上调,16个下调)进行qRT-PCR的表达量验证。实验结果显示,绝大多数DEGs的qRT-PCR结果与转录组测序结果相一致。

研究亮点

1、目前研究植物和PGPR的互作,已有的报道主要关注在互作过程中植物的各种生理变化,本研究从PGPR诱导植物耐盐的基因表达谱及相关分子机制上进行分析,有创新性和重要研究意义。

2、转录组数据分析方面,很好地利用MapMan的方法整合和直观地展现DEGs在各个通路中的变化和功能;通路分析方面,也比较全面详细地将DEGs的表达变化和基因功能结合起来,从而很好地揭示了分子机制。

3、本文的实验验证较为丰富,除了常见的qRT-PCR,还有一些生理生化以及关键基因突变体表型的分析验证。