GFP 标记的植物促生菌的定殖能力研究

2018-05-12 23:51:05 200

GFP 标记的植物促生菌B96-Ⅱ-gfp 的定殖能力研究
植物促生菌(Plant growth promoting bacteria,PGPB)是一类自由生活在土壤及植物根际、根表、叶际, 对植物生长有利的细菌的统称[1]。PGPB 能够通过固氮、溶磷、溶铁, 并产生植物激素, 如生长素、赤霉素、细胞分裂素和乙烯等植物所短缺的物质来直接影响植物的代谢; 也可通过产生特定种类的抑菌物限制病原菌的生长, 间接促进植物生长, 其在
农业生产中促进植物生长、防治植物病害以及环境保护方面具有十分重要的意义[2]。在PGPB 的推广应用过程中, 与植物根际促生细菌(Plant growthpromoting rhizobacteria, PGPR)一样存在田间效果不稳定的问题[3]。国内外大量研究结果表明, 影响细菌在植物和土壤中定殖能力的因素主要有细菌的生理学特征[4−6]、细菌细胞表面性质[7]、植物对根部定殖的影响[8]、土壤结构[9]、土壤温度[10−11]和土壤pH[12−13]等, 这些因素的综合作用决定了细菌在根部定殖能力的强弱, 从而也决定着生物防治的成功与失败。因此, PGPB 在引入环境的定殖微生态研究成为近年来人们关注的重点。现代标记基因技术的建立与发展, 为细菌定殖的微生态学研究提供了有效手段。LacZ、gus、xylE 以及lux 等标记基因已被广泛应用于微生物的环境示踪[14−15]。其中绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)标记系统由于荧光性能稳定、检测方便、灵敏度高以及表达不受种属限制等特性, 而越来越为人们重视, 并被成功地用于研究细菌在植物根部的定殖[16−17]及工程菌向环境的释放[18]等, 然而大多定殖研究时间不足半年[17,19],不能充分了解细菌在土壤中的长期存活状况, 周年定殖动态研究更是鲜有报道。

山西省农药重点实验室经过10 多年的研究, 筛选出了具有广谱防病促生功能的一批拮抗菌, 如BC98-I, B96-Ⅱ等, 这些拮抗菌可以通过产生几丁质酶和拮抗蛋白等抑菌物以及诱导植物体内的抗性酶等方式防治黄瓜枯萎病、西瓜枯萎病、青椒枯萎病、芦笋茎枯病等多种土传病害[20−23]。本研究采用GFP 标记技术, 通过对土壤中和植株上标记菌的定期回收检测, 探明植物促生菌B96-Ⅱ在土壤中的周年定殖动态及在黄瓜根、茎和叶上的定殖分布, 以期为植物促生菌的生产应用提供理论依据。

植物促生菌

1 材料与方法
1.1 试验材料
广谱拮抗菌 B96-Ⅱ是山西省农药重点实验室从沤肥浸渍液中分离筛选到的1 株对多种植物病原菌具有较强拮抗作用的枯草芽孢杆菌, B96-Ⅱ-gfp 是携带有绿色荧光蛋白基因和霉素抗性基因的B96-Ⅱ标记菌株[24]。供试土壤为山西省农业科学院蔬菜研究所实验菜园土壤,经山西省土壤环境与养分资源重点试验室测定, 土壤有机质含量12.4g·kg−1、全氮0.6 g·kg−1、有效磷8.70 mg·kg−1、速效钾112.5 mg·kg−1、Fe 7.91 mg·kg−1、Mn 3.54mg·kg−1、Cu 0.90 mg·kg−1、Zn 2.23 mg·kg−1、Ca 0.13 mg·kg−1、Mg 343.4 mg·kg−1, pH 8.80。供试黄瓜品种为“春秋王”。

1.2 试验方法
1.2.1 菌液和黄瓜种子的准备拮抗菌菌液的准备: 将B96-Ⅱ和B96-Ⅱ-gfp 分别接种于LB(胰蛋白胨10 g·L−1, 酵母粉5 g·L−1,氯化钠10 g·L−1, pH 7.0)液体培养基中, 37 ℃、150r·min−1 振荡培养24 h, 通过血球计数法调整两菌液浓度均为9.0×107 cfu·mL−1。黄瓜枯萎病病原菌[Fusarium oxysporum (Schl.) f. sp. cucumerinumOwen]菌液的准备: 接种新鲜培养的黄瓜枯萎病病原菌于PDA(马铃薯200 g·L−1, 葡萄糖10 g·L−1)液体培养基中, 28 ℃、150 r·min−1 振荡培养, 待孢子大量形成时用双层灭菌纱布过滤培养液, 用无菌水稀释成孢子含量为8.0×104 cfu·mL−1 的病原菌孢子悬浮液。黄瓜种子表面消毒、清水漂洗后28 ℃催芽待用。

1.2.2 盆栽试验
盆栽用土的准备: 将土壤过40 目筛后分为2 份,其中1 份加入自来水制成自然土, 另1 份加入等体积病原菌孢子悬浮液制成带病土, 再将自然土和病土分别平分为3 份, 第1 份加自来水, 第2 份加B96-Ⅱ培养液, 第3 份加B96-Ⅱ-gfp 培养液, 共6个处理, 装钵, 每个处理5 钵。将催芽的种子播入不同处理中, 每钵10 穴, 每穴3 粒。种子出苗后常规管理。
1.2.3 B96-Ⅱ-gfp 在土壤中的定殖动态分别于盆栽试验开始后的0 d、1 d、7 d、10 d、14 d、18 d、28 d、77 d、90 d、120 d、150 d、180 d、210 d、240 d、270 d、300 d330 d、360 d, 取5~10cm 层土样, 用无菌水系列倍比稀释后, 分别吸取100 μL 悬浮液涂布LB 氯霉素抗性平板, 37 ℃培养24~48 h, 根据抗性平板上生长的菌落形态和荧光显微镜下发出的荧光信号鉴定并计数B96-Ⅱ-gfp 的数量。1.2.4 B96-Ⅱ-gfp 在土壤中的垂直空间定殖分别在黄瓜植株生长的苗期(10 d)和成株期(35d)取盆中表层(0~4 cm)、中层(4~8 cm)和底层(8~12cm)土样, 用无菌水系列倍比稀释后, 分别吸取100μL 悬浮液涂布LB 氯霉素抗性平板, 37 ℃培养24~48 h, 根据抗性平板上生长的菌落形态和荧光显微镜下发出的荧光信号鉴定并计数B96-Ⅱ-gfp 的数量。1.2.5 B96-Ⅱ-gfp 在黄瓜植株上的定殖分别取各处理成株期(37 d)黄瓜的根、茎和叶,用无菌水清洗组织表面, 洗涤液经8 000 r·min−1、4 ℃离心10 min, 去上清液, 用一定体积的生理盐水充分悬浮沉淀。分别吸取100 μL 悬浮液涂布LB氯霉素抗性平板, 37 ℃培养24~48 h, 根据抗性平板上生长的菌落形态和光显微镜下发出的荧光信号鉴定并计数B96-Ⅱ-gfp 的数量, 以确定组织表面B96-Ⅱ-gfp 的数量。再将不同部位的组织在70%的酒精中浸泡10 s, 然后用100 mL 无菌水冲洗3 次,进行表面消毒, 在无菌条件下研碎, 用无菌水系列倍比稀释后, 分别吸取100 μL 悬浮液涂布LB 氯霉素抗性平板, 37 ℃培养24~48 h, 根据抗性平板上生长的菌落形态和荧光显微镜下发出的荧光信号鉴定并计数B96-Ⅱ-gfp 的数量, 以确定植株体内B96-Ⅱ-gfp 的数量。

2 结果与分析
2.1 B96-Ⅱ-gfp 在土壤中的时间定殖规律通过对土壤中标记菌的定期回收检测, 探明了B96-Ⅱ-gfp 在土壤中的长期定殖规律(图1)。接种1 d时, B96-Ⅱ-gfp 在自然土壤中定殖的数量为3 486.6cfu·g−1(干土), 定殖率为0 d 时的0.38%, 存活数量显著下降。此后B96-Ⅱ-gfp 在土壤中定殖的数量呈波浪状趋势变化。经对1 d、7 d、10 d、⋯、360 d等17 组自然土壤中定殖的B96-Ⅱ-gfp 数据的多重分析比较, 与1 d 时土壤中的数量相比, 1~10 d、14~28d 和120~180 d 时土壤中B96-Ⅱ-gfp 的数量呈显著上升趋势, 180 d 时自然土B96-Ⅱ-gfp 数量为2.7×104cfu·g−1(干土); 300~360 d 时土壤中B96-Ⅱ-gfp 的数量则显著减少, 其余时间B96-Ⅱ-gfp 的数量呈下降趋势, 但与1 d 时的数量无显著差异。B96-Ⅱ-gfp 在黄瓜枯萎菌病土中的定殖动态与在自然土中的定殖规律类似。对自然土和病土中定殖的B96-Ⅱ-gfp 数量的独立样本t-测验表明, 在0~360 d 的18 组t-测验中, 除14 差异不显著外, 还有4 组差异显著(7 d、77 d、90 d 和180 d), 可见土壤中病原菌的存在对B96-Ⅱ-gfp 的定殖还是有一定的影响。

2.2 B96-Ⅱ-gfp 在土壤中定殖的垂直空间规律
分别在盆栽黄瓜植株生长的苗期(10 d)和成株期(35 d)取表层、中层和底层土样进行回收检测。结果表明: 在盆钵的表层、中层和底层土壤均可检测到B96-Ⅱ-gfp 的存在; 10 d 时表层、中层和底层土壤中检测到的B96-Ⅱ-gfp 数量的比例为1︰1.8︰2.7,35 d 时土壤中B96-Ⅱ-gfp 的数量比10 d 时显著减少,但底层B96-Ⅱ-gfp 的数量与表层数量的比例却显著增加, 表层、中层和底层土壤中B96-Ⅱ-gfp 数量的比例变为1︰2.4︰4.3(图2)。这表明在盆栽植株生长过程中, B96-Ⅱ-gfp 在不同深度土层的定殖数量随土壤深度增加而增加。


2.3 B96-Ⅱ-gfp 在植株中的定殖状况
黄瓜成株期(37 d)的检测结果表明, 标记菌株B96-Ⅱ-gfp 在黄瓜的根、茎和叶上均能定殖。B96-Ⅱ-gfp 在自然土中种植的黄瓜根部的定殖数量(7.2×104 cfu·g−1)最多, 其次为茎部(143.3 cfu·g−1),叶部定殖的数量最少(6.6 cfu·g−1); 体内定殖的B96-Ⅱ-gfp 的数量多于体表定殖的数量, 在根内定殖的B96-Ⅱ-gfp 数量(7.0×104 cfu·g−1)远大于根表(2.3×103 cfu·g−1), 茎内部定殖的B96-Ⅱ-gfp 数量(93.3 cfu·g−1)是茎表面B96-Ⅱ-gfp 数量的2 倍, 而在叶部的内外定殖B96-Ⅱ-gfp 数则相近。在接种黄瓜枯萎病病原菌的土壤中, 黄瓜根、茎和叶部的标记菌数量分别为1.5×105 cfu·g−1、686 cfu·g−1 和74cfu·g−1, 显著高于自然土中生长的黄瓜同一部位标记菌数量。其中,根内定殖的B96-Ⅱ-gfp 数量(1.0×105 cfu·g−1)是根表面B96-Ⅱ-gfp 的2 倍(5 333cfu·g−1), 茎内部定殖的B96-Ⅱ-gfp 数量(566 cfu·g−1)是茎表面的4.7 倍(120 cfu·g−1), 而在叶内定殖的B96-Ⅱ-gfp 数量(67 cfu·g−1 )远大于叶表(6.7 cfu·g−1)的定殖数量。

2.4 B96-Ⅱ-gfp 对土壤中3 大微生物类群的影响
0 d 时由于B96-Ⅱ-gfp 的添加, B96-Ⅱ-gfp 处理的土壤中细菌数量显著大于对照, 但在随后的14 d和28 d 时, 处理与对照土壤中细菌数量无显著差异(图3a)。土壤中真菌数量随培养时间推移呈逐渐上升趋势, 28 d 时对照土壤中真菌数量比0 d 时增加3.0 倍,而B96-Ⅱ-gfp 处理土壤中真菌生物量只增加1.4 倍,表明B96-Ⅱ-gfp 抑制了土壤中真菌的生长(图3b)。土壤中放线菌数量随培养时间推移也呈总体上升趋势, 但3 次取样检测均表明, B96-Ⅱ-gfp 处理与对照土壤中放线菌数量差异不显著, 说明B96-Ⅱ-gfp的加入未对土壤放线菌数量产生显著影响(图3c)。

2.5 B96-Ⅱ-gfp 对黄瓜植株生长的影响
研究表明(表1), 在人工加入黄瓜枯萎菌孢子悬浮液后, 对照及标记菌B96-Ⅱ-gfp 处理的盆栽黄瓜均发病明显, 但标记菌B96-Ⅱ-gfp 处理的盆土中黄瓜植株的发病率显著低于未加标记菌B96-Ⅱ-gfp 的对照, 防治效果为57.1%; 且标记菌B96-Ⅱ-gfp 处理的黄瓜株高、鲜重和干重与对照相比均有不同程度地增加, 特别是成株期(35 d), 黄瓜株高、鲜重和干重分别增加18.8%、55.2%和46.2%。另外, 标记菌对黄瓜的防病促生作用与未经标记的出发菌B96-Ⅱ相比无显著差异。

3 讨论
本研究表明, B96-Ⅱ-gfp 可在盆栽土壤中长期稳定定殖。与自然土壤相比, 病土中黄瓜枯萎菌的引入对标记菌B96-Ⅱ-gfp 的定殖产生了一定影响。定殖前期, 病土中B96-Ⅱ-gfp 数量等于或少于自然土中的数量, 但经过较长时间的定殖后, 病土中标记菌数量反而等于或多于自然土中的数量, 这暗示黄瓜枯萎菌与标记菌B96-Ⅱ-gfp 之间可能存在某种特殊感应。有报道表明病原真菌和潜在的生防细菌间有信号传输, 德巴利腐霉(Pythium debaryanum)产生的海藻糖是其生防菌荧光假单胞菌ATTC17400的正调节因子[25]; 但甜菜根围的极腐霉(P. ultimum)对其生防菌株荧光假单胞菌F113 的5 个基因片段有负调节作用[26]。由此可推断黄瓜枯萎菌也可能产生某种特殊信号, 对其生防菌B96-Ⅱ-gfp 进行调控, 但这还需进一步证实和研究。防治土传病害的理想拮抗菌不仅要求拮抗能力强, 而且要求生活力强, 能在寄主植株根部和土壤中成功定殖。本试验表明, 拮抗菌株B96-Ⅱ-gfp 在土壤及黄瓜植株中具有较强的持久定殖能力, 这对病害的防治有积极作用。同时研究还发现, 在定殖的冬季12~2 月(90~150 d), 白天最高土壤温度都在0 ℃以下, 但B96-Ⅱ-gfp 的数与1 d(9 月12 日)时相比并未显著减少, 反而随时间推移当土壤温度逐步升高时(第2 年2~9 月), 其数量却呈逐渐下降趋势。Loper 等[11]的研究表明, Pseudomonas 的两个株系在马铃薯根围定殖最佳温度为12 ℃或18 ℃, 但这两个株系生长的最适温度是28 ℃或30 ℃。Gutterson 等[10]发现P. fluorescence 的菌株Hv37 在16 ℃或 20 ℃时能有效地在棉花根围定殖, 但如果温度升到24 ℃, 它的根围种群密度会下降100倍。这些现象即引入微生物在土壤的定殖数量随土壤温度的升高而减少, 可能的原因是较低温度下土著微生物的活动受到影响, 从而有利于引入微生物的定殖。由此表明拮抗菌在环境中的定殖能力与温度有密切关系, 这对于指导生防菌的田间应用具有重要意义。

 文章出自:
郝变青 山西大学黄土高原研究所
马利平,乔雄梧 山西省农业科学院山西省农药重点实验室

 

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