GFP蛋白在微生物根际定殖研究中的应用

GFP蛋白在微生物根际定殖研究中的应用

2018-05-29 15:07:29 2

绿色荧光蛋白GFP在微生物根际定殖研究中的应用

荧火虫、深海鱼类和腔肠动物甚至一些真菌及古细菌都具有自身发光的能力,发光生物的这种能力是它们自身所具有的一类统称为“荧光蛋白”的物质所赋予的。绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP) 最早是从维多利亚发光多管水母中发现并纯化得到的一种天然荧光蛋白。

1 绿色荧光蛋白(GFP)的特性
作为荧光标记分子和报告基因,GFP 具有许多其他荧光蛋白所不具备的优良特性。GFP 是目前惟一能在活细胞中表达的发光蛋白,它不需要任何底物和辅助因子就能够在多种活体生物体内进行异源表达,因此不会像其它的报告基因如分泌型胎盘磷酸酯酶(SEAP)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖苷酸酶(GUS) 和萤火虫荧光素酶(LUC) 等由于需要昂贵的底物和辅助因子而在应用中受到限制。

GFP表达灵敏度高, 单细胞水平的表达也可识别到,且表达产物稳定。GFP 它与目的基因融合后,对目的基因的结构和功能没有影响, 不消耗生物体的能量,大量表达对细胞也无毒性作用,细胞仍可连续培养; 是可广泛用作细胞内基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移及相互作用、信号传递、转染与转化,以及细胞的分离与纯化等的良好标记。

GFP 的表达具有广谱性,迄今为止,GFP 已经在细菌、蓝细菌、酵母、植物、真菌、鱼类及哺乳动物中表达和应用;可进行活细胞定时定位观察,无论在真核细胞还是在原核细胞中表达后,它都能自发产生荧光蛋白,在蓝光或紫外光激发下产生绿色荧光,借助激光共聚焦显微镜(LSCM),可进行活细胞实时定位观察,更能接近自然真实状态,使研究更为方便。

GFP 的载体易于构建,由于GFP 分子量较小,仅为27~30 kD,编码GFP 的基因序列也很短(约2.6 kb),便于同其它序列一起构建多种质粒,而不至于使质粒过大影响转化频率; 易于得到突变体,GFP 中氨基酸的替换可产生不同光谱特性的突变体,且增强了荧光强度,适合在不同物种中专性表达。

基于以上这些特性,GFP 在近些年来已成为生命科学研究中广泛应用的一类分子标记物质, 以GFP 为报告基因成为基因转移研究领域的热点之一,并成功应用于多种转移研究系统和靶细胞中。

2 绿色荧光蛋白的检测
检测GFP 标记的微生物可用手提紫外灯、荧光分光光度计、荧光显微镜、流式细胞仪以及激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)等。其中,长波紫外灯可简单、直接、方便地对标记体进行定性检测;荧光分光光度计可以对GFP 标记的细菌群体细胞进行精确的定量检测; 荧光显微镜、流式细胞仪和LSCM更适合对单个GFP 标记菌进行直接、实时地检测。LSCM 系统是一种集显微镜、激光和计算机三者为一体的新型显微镜,越来越多的应用于荧光报告基因的检测, 尤其适合于检测相对较厚的样品。

LSCM 把光束聚集到样品的某个层面, 通过改变聚焦的深度便可获得样品各个层面的光学图像,与电子显微镜相比,无需制作超薄切片既可进行原位观察。GFP 标记技术与激光共聚焦扫描显微术相结合具有电镜技术及其它显微术所不可替代的功能,尤其适用于原位、实时检测目标微生物在生态环境中的动态变化和微生物根际定殖的研究。

3 绿色荧光蛋白在微生物根际定殖研究中的应用
长期以来,农业有益微生物(生防菌、溶磷菌、解钾菌和根瘤菌等)一直面临应用效果不稳定的问题,而造成不稳定性的主要原因是这些有益微生物在不同条件下作物根际定殖能力的差别[12]。因为只有在植物根际成功定殖,才能发挥其作用。近年来随着分子生物学向微生物生态学的渗透,特别是标记基因技术的建立与发展,为开展微生物根际定殖的生态学研究提供了有效的手段。

GFP 所具有的特性已经使它成为一种快速、简便、经济的标记基因,可进行原位、实时跟踪监测目标微生物在其施入环境的生长繁殖、定殖、分布及与其他微生物和作物的互作关系。因此,GFP 被认为是当前用于分子生态学研究中最理想的报告基因,成为近年来研究微生物根际定殖的最热点的方法。您还在用荧光显微镜检测GFP吗?

Gage 和Bobo借助穿梭载体pTB93F 在首楷根瘤菌里组成型表达GFP 基因, 并观察到根瘤菌侵染根系及根瘤形成的全过程。Bloemberg 等构建质粒pSMC2,pGB3,pGB4,pGB5 标记根际促生菌荧光假单孢Pseudomans fluorenscent,利用激光共聚焦显微镜可检测到P. fluorescens WC5365 能在番茄幼苗的根表与表皮相邻的边界处形成微菌落。Nomander等利用GFP 标记的P. fluorenscent 菌株DR54-BN14 接种生长在不同土壤中的燕麦植株, 用激光共聚焦显微镜原位检测了标记菌在燕麦根际的定殖、生长与分布状况。

Unge 等构建gfp-luxAB双标记系统,分别转化假单胞菌和大肠杆菌,接种土壤30 d 后,检测GFP 标记细胞仍有较高数量,但发光酶活性由于营养条件限制而缓慢下降。Bea 和Knudsen用pNOM102、携带潮霉素抗性载体pAN7-1及携带GFP 基因载体pTEFegfp 共转化生防木霉(Trichoderma harzianum) 获得了同时携带3 种标记因的稳定转化子,转化菌株的形态学表型性状和生理特征与野生型并无明显差别,用激光共聚焦显微镜检测转化菌株在土壤中的活性和在作物根际的定殖。Chelius 和Triplett利用两个GFP 标记的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneunoniae)菌株监测其在玉米幼苗上的定殖状况。

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近几年, 国内有关GFP 在微生物根际定殖方面的研究报道有所增加。卢志军等[16]以GFP 基因标记根瘤菌XJ83097, 研究自然状态下G-XJ83097 在苜蓿根际的分布、定殖和动态变化。李金云等利用绿色荧光蛋白基因(gfp) 标记示踪, 研究了葡萄根癌病生防菌葡萄土壤杆菌E26 菌株应用到田间后在玫瑰香葡萄根表面和根际土壤中的群体数量变化, 比较了E26 菌株与葡萄根癌病原菌K308 菌株室内人工接种后在玫瑰香葡萄苗茎和根外植体伤口部位的附着情况,证实了生防菌E26 能够和病原菌K308 一样附着于葡萄根部伤口处。

邱珊莲等将GFP 基因标记的甲基对硫磷降解菌DLLBR 接入青菜根际土壤中,以激光共聚焦显微镜检测其在小青菜植株根部和植株内的定殖及分布,发现标记菌株在土壤中的存活力很高,与对照相比,更能促进植株内菌体结构的变化,为以后研究农药残留降解菌在土壤和植物中的降解过程和降解作用机制做了前期研究。张霞等[19]构建了含有荧光假单胞菌自身启动子Pp303的中间质粒载体pGFP, 然后利用mini-Tn5 转座子,通过接合转移将两个带有不同启动子的绿色荧光蛋白基因分别整合到荧光假单胞菌P303 染色体上,获得了在488 nm 波长下发光稳定的P303m1 和P303m3 菌株, 然后对绿色荧光蛋白标记的荧光假单胞菌P303 在大白菜根际的生存竞争和定殖能力进行了检测。

结果证明,荧光假单胞菌在自然土壤中和大白菜根际都有较强的定殖能力。王浩等将绿色荧光蛋白转入高效、抗逆、广适应性的快生大豆根瘤菌Sinorhizobium fredii CCBAU01287 中,获得含gfp 基因的转基因菌株, 用于实时监测根瘤菌在大豆根部的早期定殖情况和定殖密度的测定,研究大豆根瘤菌在大豆根部定殖结瘤的情况。

范晓静等[21]用枯草芽孢杆菌168 菌株rpsD 基因的启动子替换质粒Pgfp4412 中蜡状芽孢杆菌4412 启动子, 从而构建了能在枯草芽孢杆菌中表达绿色荧光蛋白基因gfpmut3a 的载体pS4GFP,将其导入具有内生、防病、促生作用的野生型枯草芽孢杆菌BS-2 菌株中, 在小白菜体内的定殖研究结果表明,该菌株能够在小白菜根际及根、茎、叶内定殖和传导。叶丽丹等[22]选用GFP 基因作为报告基因对生防真菌-球毛壳菌进行标记, 通过构建和转化EGFP 表达载体, 得到氯嘧磺抗性的转化子,用以研究球毛壳菌与立枯丝核菌的拮抗机制,证明了球毛壳菌对立枯丝核菌的拮抗机理主要是重寄生作用。

以上研究表明,GFP 标记系统已成为目前国内外在微生物根际定殖方面的重要研究工具,并且已经明确了微生物在植株根际定殖机理和微生物定殖的一些特性。如证实了微生物在根际的定殖过程分为两个阶段, 第一阶段是微生物与寄主互作,附着于根上,并随根类的延长面移动;第二阶段是微生物在其附着位点扩展、繁殖、与土著微生物竞争并存活下来。

在此基础上,研究者还发现微生物定殖在处于发育早期的植物中,定殖后的微生物并不是静止不动的, 而是能在植物体内不同部位转移的,微生物对宿主的选择也不是随机的,而是存在一定的专一性,并且微生物在植株体内的转移不是漫无目的的,而是它对特定的部位有所偏好,不同微生物定殖同一作物的能力有所差异,同时施入时具有竞争性。

4 存在问题与展望
GFP 的应用已经渗透到生命研究的各个领域并取得了巨大的成就。GFP 可以用于宏观领域的研究,如研究生防菌或病原菌的生态、防效等,更多地则被用于微观领域的研究,如病原菌与其寄主的关系、基因表达、细胞亚结构和蛋白质功能等[23]。作为分子标记物,GFP 在实时、原位研究微生物的空间定位、基因表达、微生物与环境相互作用等方面开创了一条全新的道路,展示了良好的应用前景。

GFP本身也将不断被改进及优化,GFP 的应用在技术上将出现更多的创新, 其应用范围将会越来越开阔。但在研究中仍然存在着一系列的问题,如荧光强度的非线性性质使其定量非常困难;多数生物具有微弱的自发荧光现象, 并有着类似的激发和发射波长,影响某些GFP 的检测;新生GFP 通过折叠和加工成为具有活性的形式,过程十分缓慢;紫外激发对某些GFP 有光漂白和光破坏作用, 导致荧光信号快速丧失等。

但是,基于细菌间高频的基因转移而带来的安全性的问题,研究者应该谨慎地在开放的环境中使用含有GFP 基因的转基因工程菌, 从而减少由此可能带来的对人类及环境潜在的风险。GFP 在现代微生物学中的研究已经越来越深入, 认识了在分子水平上植物与微生物之间的关系,对它们的理解不再是简单的生产者与分解者的关系,且逐渐发现它们和谐共生的秘密。应该相信,随着研究的不断深入, 认识的持续提高,GFP 在植物生防菌的理论研究和实际应用以及生态型农业中的应用前景将十分广阔。您还在用荧光显微镜检测GFP吗?