根围促生细菌在植物根围定殖研究进展

根围促生细菌在植物根围定殖研究进展

2018-05-29 15:03:34 3

根围促生细菌在植物根围定殖研究进展

植物根围促生菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria, PGPR),在国内外的商品化进程中之所以受到很大程度的控制主要在于其应用效果的不稳定(Sandra, 2002)。生防的稳定性是影响生物防治效果的关键问题,多年来受到国内外学者的广泛关注。一般来说生防稳定性受到诸多因子的影响,包括生防制剂本身、病原生物、寄主植物和环境因子。

在有益生防菌与宿主植物的相互作用过程中,生防菌必须在根内或根表组织上定殖生长才能对植物生长产生影响,大量的研究表明,接种至土壤的生防菌株能否在植物根围成功定殖对于其作用的发挥至关重要。根围定殖能力一直被认为是生防的关键所在(Klopper, 1992; 郭坚华等,1996; Annouschka, 2003)。因此研究生防菌株的根围定殖对于揭示其生防机制、提高菌株根围的适应性和增产具有十分重要的意义。

1 根围定殖的概念
Kloepper 等人将带天然抗生素标记的植物根围促生菌(PGPR)菌株接种到马铃薯种薯块表面,然后再回收该菌株,这是首次使用根部定殖(Root Colonization)一词,其定殖量一般采用自根表回收到的引入菌株种群数量来表示(Kloepper and Beauchamp, 1991),但是没有明确给根部定殖下定义。随着根部定殖研究的发展,学术界普遍认为根部定殖是指一种外来引入菌株在植物根部定居并繁殖的主动过程,而不只是简单的引入菌株与植物根被动相遇的过程,应该包括引入菌株与根围土著微生物的相互竞争与适应,并在植株根部以促进植株健康生长的方式有效定居并繁殖。

目前普遍接受认可的定义为:根围定殖是指在有土著微生物存在的情况下,接种至种子或植物无性繁殖体表面部位的微生物在根部繁殖并持续其种群的能力(王海华等,2002)。

不少研究表明,微生物在植物根围的有效定殖,对根圈微生态及微生物-植物的互作产生较大的影响。目前在根围定殖研究方面人们关注较多的是定殖机理及其对根围微生态的影响。早在70年代中期,Bowen 和Rovira(1976)就提出了外来引入微生物,尤其是细菌在根部分布机制的四种可能方式,包括引入细菌自身的运动能力;植物根的生长对细菌的带动作用;沿根向下运动的水流(如灌溉水等)对于引入细菌分布至新的根段部位起着重要作用;植物根系内真菌菌丝上粘附的细菌会随着菌丝的伸长并通过菌丝的转运作用沿根分布,另外这些细菌在整个散布过程中也许还会受到来自其他微生物的竞争。

通过研究发现,植物的种类对其根围的微生物群落的影响较大,不但影响植物根表面的微生物种群密度,对群落的组成,即微生物的种类有较大的影响,同时植物的健康状况与其所在的微生物区系状况关系十分密切(Smith, 1999; Harsh,2004; 赵海新, 2009)。

2 影响微生物在植物根部定殖因素
影响微生物定殖的因素有很多,但总的来说可以归纳为两大类:一类是生物学因素,包括微生物自身特性、接种数量、植物根系分泌物等生物学因素;一类是非生物学因素,包括土壤类型、土壤含水量和Ca2+等土壤理化性状。

2.1 引入细菌自身性状
2.1.1 细菌细胞表面性质
引入细菌细胞表面的性质对于根的吸收、对土壤中胶体的长久粘附以及与其他土著细微生物的识别十分重要。早期就有研究指出,微生物与植物根凝集素(Agglutinin)的结合能力对粘附(Adhension)具有重要影响(Heijnen et al, 1993; Ben, 2001)。研究证明,专化的识别作用促进了一些假单胞菌对菜豆根围定殖,其中根瘤菌(Rhizobium)、克利伯氏菌(Klebsiella)和肠杆菌(Enterbacter)的纤毛(Pili)对植物根的粘贴十分重要;荧光假单胞(Pseudomonas fluorescens) 2-79 对玉米根的粘贴频率大大超过无纤毛的细菌细胞(张炳欣和张平, 2000)。

2.1.2 细菌生长速率
细菌的生长速率对其在植物根部定殖具有重要影响,对于筛选优良的生防菌株并有效预测其在根围的作用也具有重要意义(Bowen, 1991)。但要精确测定引入细菌在植物根围的生长速度并非易事。Christensen 和 Funck-Jensen(1989)曾采用-HTdr 参合技术(The TritiatedThymidineIncorporation Technique)测定了一株PGPR 菌株在甜菜根围的生长速率,结果表明其生长一代的时间约为106 h。Sinclair 和Alexander(1989)在80 那年代曾提出,当细菌被原生动物捕食时,生长较慢的细菌种群数量下降较快,而生长速度较快的细菌种群数量下降不明显或较慢,这与细菌繁殖的补偿作用有关即也与其生长速度密切相关。

2.2 接种量
影响细菌在根部定殖和根圈适应的因素很多,其中根围或种子表面初始接种量是一个重要的因素。在一定范围内加大接种量可以增强细菌在植物根圈的定殖和竞争能力。Jjemba 和Alexander (1999)选择了大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)UMR161、754,食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidovorans),节杆菌(Arthrobacter sp.),热带根瘤菌(Rhizobium.tropici)CIAT889 等菌株,对其使用不同浓度接种后300h内在大豆植株根围的定殖动态进行监测,结果发现以107 cells g-1 siol 接种后,在检测期间内植株根围的定殖量稳定且远高于以103 或105 cellsg-1 siol 接种后的定殖量。

2.3 植物根系分泌物
对于在植物根围定殖细菌,基质的营养条件及分布是其分布的主要调节因子。因为受到植物的作用,根围中营养成分的含量和种类远比根围外土壤中的丰富,因此引入细菌在根围上的分布区段与细菌对营养的要求关系密切,或者说与根不同部位渗出分泌物的不同有一定的关系(Nijhuis et al,1993)。目前普遍认同根围微生物的生存依赖于根渗出物或植物分泌物。渗出物的类型和数量又是受环境条件影响的,运用遗传学进行育种增加植物新品种的同时改变了植物根渗出物的质和量(Smith et al, 1999; Thimmaraju, 2007)。

因此不同的作物、或同一作物不同品种(如抗病或感病品种),或同一品种不同生育期,根围微生物种群密度也有较大的差异,可以说植物的育种工作也是对植物根围微生物区系的改变。反之,植物根围微生物,尤其是有益微生物,它们能抑制病原物对植物的侵染,促进植物生长,对植物有利,如生防菌和根围促生菌(PGPR。可以说,植物和根围微生物的相互作用直接影响引入微生物在根围的定殖。

Smith等(2002)在用蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)UW85 进行生物防治时,首次证实了有关植物与抑制病害的细菌相互作用的遗传学基础,即使是定殖在根围的PGPR 在促进植物生长时可能也是受植物影响的。张晓霞等人(2003)在研究紫云英根瘤菌JS5A16 菌株在不同水稻品种根部的定殖动态时发现,不同水稻品种根部的定殖密度不同。因此通过研究植物的基因型和微生物生态学,可以了解寄主植物与其根围微生物之间的关系,从而增加有益微生物在根围的密度,提高它们在根部的定殖能力。

2.4 土壤环境
2.4.1 土壤质地
不同的土壤类型,其土壤质地、肥沃程度、有机质含量等理化特性均不相同,引入细菌定殖和竞争能力也不同。土壤质地既影响引入细菌的被动传送,也影响其在根部的定殖。大量研究结果表明:细菌在质地较轻(粗)的土壤中的运动距离要比在质地较重(细)的土壤中大,其根部定殖的水平也要高。与土壤质地有关的土壤容重(Bulk Density)对于根部的定殖也有重要影响(Lawrence et al, 1987; Heijnen et al, 1993。

Rattray 等(1993)曾发现,小容重(0.82g/cm3)条件下,荧光假单胞(P. fluorescens) 在小麦根部的定殖水平要比在大容重(1.00g/cm3)条件下的高,但要证实土壤质地对引入细菌在根部的定殖能力的确切影响并非易事。因为土壤有关的其他一些因素也可能直接导致定殖的差异:土壤粘重、通气性差对细菌的存活和寄主生长都不利,另外土壤的肥力水平也是一个相关因素,在这方面的研究多集中在土壤氮、磷、钾水平的影响上。

2.4.2 土壤含水量
土壤水分含量主要影响引入细菌在植株根部定殖的群体水平,而灌溉的方式主要影响细菌沿根的分布(Trotman & Weaver, 1995)。当土壤水基质势较高时,水会充满土壤孔隙导致O2 不足,造成细菌缺氧;反之,土壤中水分含量较低时,细菌的运动性、细胞的张力和养分的扩散性则会下降。曹景勤(1999)研究发现土壤中水分含量的多少会对根瘤菌定殖存活产生很大的影响。此外,土壤中的渗漏水对引入细菌的长距离传输也有重要作用。

2.4.3 土壤温度
土壤温度对于引入细菌在植株根部定殖也有较大的影响。一方面,土壤温度可以对植物的生长发育、根系分泌物的成分与质量造成影响,进而对引入细菌的根部定殖造成影响;另一方面,不同的温度会对引入细菌自身的生长繁殖与土著微生物的相互作用产生直接影响,最终影响引入细菌的有效定殖。但温度对于根部定殖的影响十分复杂,Heijnen 等人(1993)认为较高的土壤温度(如22°C)有利于根部的定殖;而Beauchamp 等人(1993)则认为低温条件(如12-16°C)有利。Gutterson 等(1990)发现荧光假单胞(P. fluorescens)的菌株Hv37在16℃或20℃时能在棉花根围有效定殖,但如果温度上升到24℃时,根围种群密度会下降100 倍。不同菌株在根部定殖的最适温度也有很大差别,如铜绿假单胞(PseudomonasAeruginosa)7NSK2 在玉米根部定殖的最适温度为30°C,耐寒菌株荧光假单胞(PseudomonasFluorescens) ANP15 的最适温度则为18°C (Seong et al, 1990)。

2.4.4 土壤 pH 值
在离体条件下,荧光假单胞菌(P. fluorescens)的最适pH 为中性或弱碱性,但是Howie等人研究发现荧光假单胞菌(P. fluorescens)2-27 在小麦根圈定殖的最适pH 为6-6.5,其原因可能是土著细菌在酸性土壤中的竞争力较弱。另外,大量研究表明,土壤pH 可影响根瘤菌的存活与根瘤的形成;显著影响木霉对病害的抑制和根围定殖。在一定程度上改变土壤pH 值可以控制土壤内土著微生物的竞争能力。

3 微生物在植物根围定殖的研究方法
生防菌和 PGPR 在应用过程中常出现的效果不稳定的现象,这使其在商品化进程中受到很大程度的限制。植物根围促生细菌只有在植物根围有效定殖后才能发挥其抑制病害、促进植物生长等作用,因此其定殖能力是十分重要的,人们对这方面的研究也越来越关注。早期的研究中,由于研究方法及条件有限,在对植物根围引入细菌的跟踪研究时,无法排除同类土著细菌对引入细菌的干扰,因而对引入菌株能否在植物根围或土壤中存活、繁殖以及其定殖的方式、位点及所起作用了解甚少。

近年来,随着分子生物学的快速发展,特别是基因标记技术的建立与发展,为开展根围细菌定殖动态的研究提供了有效手段(胡小加, 1999)。现已报道并广泛使用的检测方法包括以下四种:天然抗生素抗性标记法、外源基因标记检测技术、DNA 和RNA 探针技术以及免疫学方法等技术 (张炳欣, 2000; 王天龙, 2006)。前两种方法往往结合在一起应用于可培养的根围外来微生物的检测,而后二者可用于检测包括不可培养的根围微生物在内的所有微生物,包括活细胞或死细胞。

3.1 天然抗生素抗性标记法
抗生素标记具有简便、快速、消耗低、实用、实验结果可以进行统计分析等的优点,且不会导致原始菌株的稳定遗传性及其他重要特性变异甚至丧失,因此抗生素抗性标记方法被作为一种常用的手段用来跟踪引入微生物在土壤中的存活情况(肖相权,2009)。在运用该种方法时,可采用抗生素选择性培养基计数的传统检测,在培养基中加入所需抗生素,最常用的抗生素有利福平(Rif)、卡那霉素(Km)、链霉素(Str)、等,然后采用梯度稀释技术将适当浓度的待测稀释液涂抹到平板上,一定时间后统计平板上生长出的细菌菌落,进而推算细菌在所检测部位的分布密度。按照以上方法,也可对不同时间段内引入细菌在植物根围的定殖动态进行检测,有助于我们了解引入细菌在植物根围的种群变化动态(闫沛迎,2007)。

许多研究表明,抗生素标记能有效跟踪进入微生物在土壤及植物体内的定殖情况。Roberts等人(1997)将用利福平标记的大肠杆菌(Escherichiacoli)S17R1 与阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)501R3 来防治黄瓜猝倒病,并对其分别以种子处理及浇灌处理后的定殖动态进行了测定;仝赞华等人(2001)利用抗药性标记法研究了生防菌AS818 在大豆根围的定殖动态;翁启勇等人(2003)利用抗利福平标记法研究了生防菌株BS1在番茄、茄子根部及根围土壤中的定殖动态;为研究短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)BX-4 在作物根围的定殖及防病效果,肖相权等人(2009)通过浓度梯度法用氨苄青霉素对其进行了抗性标记,并通过番茄盆栽试验研究了其在根围土壤中的定殖规律。

应用试验显示该突变体菌株能成功在番茄根围定殖,接种20 d 后根围土壤中存活数量达到最高值1.34×108 cfu·g-1 干土,以后逐渐下降,到50 d 时趋于稳定。随着分子生物学的快速发展,这种传统的方法表现出一定局限性,如细菌对抗生素的天然抗性不稳定,具抗性标记的细菌释放到土壤中后如果遇到不利环境时,对抗生素的抗性也会降低或丧失,而土壤中的土著微生物中可能也会存在具有一定抗生素抗性的同种菌株,从而影响检测的准确性(Glandorf, 1992; 姚震声, 2003)。

因此许多研究将抗生素抗性标记与其它方法联合检测、跟踪环境中引入的微生物,如将抗生素抗性标记与lacZY 标记基因一起联合使用,研究了荧光假单胞菌(P. fluorescens)在小麦根圈的定殖动态(王平,1997);余国运(1992)用遗传双标记示踪回收、叶面印象观察等方法,研究了增产菌在小麦叶部的定殖情况;刘建等人(2001)用发光酶基因luxAB 及抗生素共同标记巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)ATCC14581,将该标记菌株制成微生物接种剂, 并利用土壤微缩系统将其接种小麦进一步研究它在小麦根围的定殖动态和散布规律。

3.2 基因标记
分子生物学技术的发展,使分子标记技术日益成熟并用于微生物的定殖及根围生态学研究。所谓基因标记即将外源的DNA 引入目的菌株,经过表达以后,受体菌的细胞能一定的方式在环境中与其它微生物相区别(Ryder, 1995)。标记基因可引入到细菌的质粒上或插入到其染色体中,在菌体中进行稳定遗传,并且具有该基因的菌体其基因的表达结果能通过特定的方式被检测到。在研究土壤微生物时,应用较多的标记基因有:生色基因,如β-半乳糖苷酶基因(LacZ 基因)、β-葡糖苷酸酶基因(Gus 基因);生物发光酶基因(如LuxAB)(Ryder, 1994; 王平, 1994; Lindow,1995);分泌型碱性磷酸酯酶(SEAP);萤火虫荧光素酶(LUC)等。但这些基因的检测都需要底物和辅助因子,因而在活体中的应用受到一定限制。绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein ,GFP) 是近年关注较多的一种报告分子,作为报告基因GFP是目前能在活细胞中表达的光蛋白之一。

β-半乳糖苷酶基因(LacZ 基因)是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因,其编码半乳糖苷酶和乳糖渗透酶,可利用乳糖裂解X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖)或其它合成半乳糖,生成蓝色沉淀,最终形成兰色菌落,因此在使用的时候方便进行快速有效的观察和检测。Naseby 等(1998)用LacZ 标记荧光假单胞菌(P. fluorescens)F113,对标记菌株及野生菌株在豌豆根围的定殖情况及其对根围环境的影响进行了研究。陈晓斌等人(2001)运用了生色基因(LacZY)标记了黄瓜根围的促生菌;楼兵干(2001)比较了LacZY 标记菌株CR56RL4 与利福平标记菌株CR56R9 在黄瓜和番茄根围的定殖能力、种群动态和在根区的分布。β-葡糖苷酸酶基因(gus基因)编码的葡糖醛酸酶催化一些荧光和组织化学反应底物的水解反应,生成容易观察的蓝色产物。

Mercante等人在2000年提出可以利用gus基因来对根瘤菌共生固氮基因的表达和根瘤菌的根部定殖动态进行检测(Mercante, 2000);Gyaneshwar(2001)等利用gus基因标记了一种具有固氮能力的植物内生细菌粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens) IRBG500,研究了该菌对水稻的定殖情况,发现接种3天以后,能在根部观察到标记的细菌定殖,在新根与根尖部分定殖的量比较高,6天以后,在新生的茎和叶中出现了标记的内生细菌;胡小加等(2004)采用基因标记技术和常规方法跟踪巨大芽孢杆菌A6(gusA)在缩影系统油菜根围的定殖情况,发现巨大芽孢杆菌在根围的定殖密度呈现“先上升后下降并趋于稳定”的特点。

但在进行组织化学分析时,需要昂贵的反应底物4-甲基伞形花酮-B-D-葡萄糖苷酸(X2Gluc),且检测方法对病原菌具有较大的破坏性,在处理组织的同时也会阻断植物病原菌的继续侵染。因此,在病原菌侵染寄主植株途径的研究中一直未取得可靠的实时实态过程(王震, 2007)。

对Lux 基因的研究始于20 世纪70 年代,Lux 基因是编码和调控细菌生物发光的操纵子,其为我们开展根圈细菌定殖动态研究提供了有效手段。其可以在非常低的含量水平和非常宽的范围内进行检测,其检测快速简便,价格低廉,因此受到了许多研究学者的关注,并开展了在农业、医学、食品工业及环境检测中的广泛应用(夏铁骑, 2008)。De wager 等(1991)将Lux 基因导人植物根瘤菌中,通过发光检测设备对工程菌产生光线的监测,从而对细菌侵人植物的整个过程进行了实时在线监测。

柏建玲等人用全套发光酶基因(luxCDABE)标记技术研究了绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)PL9,采用发光菌落平板计数法和X 射线胶片自显影法,通过盆栽试验对PL9 在棉花根部的定殖动态和分布规律进行了研究。韦兵(2006)采用三亲接合法成功用发光酶基因luxAB 标记有较强解钾能力的假单胞菌(Pseudomonas sp.)JK45 菌株,使用标记菌JK45-L 接种到种植有小麦的微缩系统的土壤中,对菌株在小麦根圈的定殖动态和散布规律。结果发现,标记菌株在灭菌土壤中的定殖水平高于不灭菌土壤,在垂直方向上主要定殖在0-10cm 根段间,且随深度增加而降低。

绿色荧光蛋白(GFP)从1962年Shimomura在水母体内被发现到1994年Chalfie首次将其基因导入大肠杆菌和线虫中成功表达,至今已经半个多世纪。GFP基因作为一种全新的非酶报告基因,具有以下特点:共用性及通用性即不具有种属特异性,它的表达几乎没有受体范围的限制在原核和真核生物中都获得了成功的表达,可与不同颜色的标记分子结合,利于进行双色检测;基因片段小,可与多种不同蛋白质的N端或C端相融合,而不会改变天然蛋白质的原有特性;表达产物可耐高温(65℃),具有宽的PH范围(6~12),能抵抗多种变性剂和蛋白酶的作用,能耐受穿透、毒素、光漂白等不利因素,所产生的绿色荧光持续时间长,且不需要任何辅助因子的作用;分子量小,对细胞无毒害,且使用方便,可进行活细胞定位观察等特性。

目前在各研究领域中受到更多青睐,并已经在细菌、蓝细菌、酵母、哺乳动物和植物中得到广泛应用(王震等, 2007)。在对生防细菌在植株根部定殖动态的研究也取得了不少的成果。Bloemberg(1997),Normander(1998)等分别利用GFP基因标记了荧光假单胞菌(P.fluorescens),对其在植株根部的生长及活动状况进行跟踪观察,发现经标记的菌株可在植物的根表处形成菌落。

张昕等(2005)将标记有GFP基因和氯霉素抗性基因的重组质粒pRP22-GFP导入生防菌短短芽孢杆菌(B. brevis)ZJY-1和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili)sZJY-116中,研究了两者在黄瓜根围的定殖规律,结果表明,在整个生育期两株生防菌株均能在黄瓜根围有效定殖,并在黄瓜盛花期和盛果期出现标记菌体数量高峰。Poonguzhali等(2008)运用GFP标记的甲基杆(Methylobacterium),对其在水稻及番茄根围区域的定殖动态分别进行研究并比较,发现该菌株可以在两种不同作物的根围与土著微生物进行竞争并有效定殖,但在表面灭菌的植株根部细胞内的定殖仅在番茄中有发现,而在水稻根部细胞内未检测到。

随着GFP的广泛应用和深入研究, GFP标记基因的种类也不断丰富,目前已经报道使用的有能够分别发出绿、蓝、黄、红四种不同颜色的光的eGFP, ecfp, eyfp, DsRed四种类型,这为微生物的定殖及互作研究提供了更多的方便。Bloemberg等(2000)对荧光假单胞菌(P. fluorescens)分别使用3种不同颜色的荧光蛋白(红、黄、绿)来分别标记,接种番茄后,通过激光共聚焦显微镜同时观察到了不同标记的菌株在根围的定殖情况。Clara等(2008)使用不同荧光蛋白对产碱假单胞(Pseudomonas alcaligenes )AVO73和类产碱假单胞(Pseudomonaspseudoalcaligenes)AVO110标记后,对其在酪梨根围的定殖情况以及其对酪梨白根腐病原菌白纹羽菌(Rosellinia necatrix)的防治效果进行测定。

上述研究表明,GFP基因作为一种活体报告基因,在植物病害研究方面尤其是微生物的根围定殖研究等表现出其他报告基因不可替代的优点,具有广泛的应用前景,是研究微生物定殖的有力工具。

3.3 DNA 和RNA 探针技术
运用特异的 DNA 或RNA 序列作为核酸探针检测根围微生物,这种DNA 探针的序列一般比较短,是该微生物独特具有的,可以是其在特殊的环境自然出现的,或是通过遗传修饰引入的,可以检测根围特定微生物与探针相匹配的DNA (Holben, 1988)。一般说来,应用DNA 探针有两种途径:一是菌落杂交法:探针与生长在培养基上的菌落的DNA 杂交(Elsas,1991);二是直接检测法:探针与从土壤中或植物样品中提取的DNA 杂交。探针可以建立在整个染色体DNA 上、一个克隆载体上特殊的插入片断、整个质粒DNA、16sRNA 序列的一部分或其它的寡聚核苷酸序列上。

探针的大小及类型取决于它在检测环境中的特异性。DNA 探针法具有较高灵敏,活细胞、死细胞均可检测。直接检测能够在培养基上检测到生长和不能生长的细胞,而菌落杂交法只能检测活的细胞。但是,可以采用MPN-DNA(Most Probably Number 最大可能计数法)杂交法进行定量分析,还以结合RNA 探针,探测可培养和不可培养的细胞。

3.4 免疫学方法
免疫学检测技术对革兰氏阴性和阳性细菌均适用,其最大优点是无论是死细胞或活细胞、可培养的还是不可培养的细胞,均可进行原位观察细胞和能定量统计,并且都可以检测到。该技术的检测原理为:外源基因能产生新的细胞外膜蛋白,可以用相应的抗体去检测,抗体与目标细菌细胞外膜的抗原成分相结合后发生特异性反应,以此同其它微生物相区别。如用标有荧光染料(例如荧光素异硫氰酸盐或其它荧光色素)的抗体和细菌细胞膜蛋白相结合;带有荧光染料或金色颗粒的二抗与结合了抗原的抗体反应。荧光标记免疫反应结合流式细胞光度技术,可以提高检测方法的专一性和灵敏度。

原位观察对根围细菌的研究有重要意义,它可以精确确定引入细菌在根围定殖的位置、在根面上覆盖的面积以及细胞能否在根内定殖。另外,也可以用酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)以及Western 印记法,将细菌细胞转移到硝酸纤维素滤膜上,再进行免疫荧光细胞染色(Vuurde,1991)。细胞外膜上抗体与抗原结合,可在光学显微镜或电子显微镜下对免疫荧光呈阳性的细胞计数,也可以通过测定ELISA 的吸光值从而对细胞数量进行统计计算。

用高倍显微镜观察载玻片上免疫荧光的菌落时,能够确定样品中可以培养和不可以培养的细胞数目,并可以直接从免疫荧光细胞染色(Immunofluorescent Colony Staining, IFCS)阳性菌落中分离可培养的细胞,便于鉴定细菌细胞。现在,细菌的根部定殖能力已成为测定各种细菌-植物系统的一个重要参数,也是对引入细菌生防能力的重要评价因素。测定引入生防细菌的在植物根围的定殖量、定殖位点、定殖持续时间等已成为揭示有益生防细菌在植株根围微生态学特征、定殖动态,增强其对病原物的抑制能力,提高其根围适应性和增产效果必不可少的研究内容。