GFP 标记短小芽孢杆菌LYMCG3在马尾松体内的定殖

2018-05-29 14:59:28 119

GFP 标记短小芽孢杆菌LYMCG3在马尾松体内的定殖
 植物内生细菌的概念由克洛珀于1992年首次提出,是指能够定殖在健康植物组织器官内、并可与植物建立和谐统一关系的一类微生物[1],是林业有益微生物中的重要生防菌资源之一[2].松材线虫病(Bursaphelenchusxylophilus)又称松树萎蔫病,是世界上极具危害的林业病害之一,国内外尚无有效的防治方法.该病主要分布在美国、加拿大、墨西哥、日本、韩国、中国和葡萄牙等国家[3].我国自1982年在南京紫金山发现以来,已迅速蔓延至安徽、浙江、山东、广东、湖北、台湾和香港等地,对我国的林业经济、森林生态和自然景观造成了巨大损失和严重破坏.

目前,国内外针对松材线虫病的生防研究主要集中在从不同地域或植物体内线虫拮抗微生物的分离筛选方面,对拮抗微生物在寄主体内的定殖动态研究相对较少.短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株LYMCG3分离自洛阳隋唐植物园马尾松的茎部,前期研究表明,该菌株对松材线虫具有较高的拮抗活性.生防细菌能否有效发挥促生抗病作用,在很大程度上要取决于其在植物体上的稳定定殖能力,可以说定殖是生防成功的关键.基于此,本研究采用扫描电子显微镜观察、绿色荧光蛋白(GFP)基因标记及激光扫描共聚焦显微镜观察相结合的方法研究短小芽孢杆菌菌株LYMCG3在马尾松体内的定殖部位和时间动态,为该菌未来的实际应用提供理论依据.您还在用荧光显微镜检测GFP吗?

1 材料与方法
1.1 材料
1)菌株与质粒:菌株LYMCG3为笔者从洛阳隋唐植物园马尾松的茎部分离,对松材线虫具有较高的拮抗活性,鉴定为短小芽孢杆菌(BacilluspumiGlus).质粒:pGFP78质粒由中国农业大学亓雪晨[9]构建,带有组成表达的gfp 基因以及氨苄青霉素(ampicillin,100 mg/mL)和四环素(tetracycline,10mg/mL)抗性.
2)植物材料:将马尾松种子在70%的乙醇中浸泡30s,之后浸入30%的过氧化氢溶液中30min,无菌水冲洗6次,然后将消毒过的种子置于含有20mL的1/2MS培养基的瓶中,放在组织培养室中
(25℃)培养,培养4个月作为细菌内生定殖接种材料;马尾松2年生盆栽实生苗.
3)培养基:菌株LYMCG3的培养及gfp 基因转化用LB培养基;马尾松无菌苗的培养用1/2MS培养基.
4)主要试剂:DNA marker购自TaKaRa公司;四环素(tetracycline)购自南京金庆祥公司,工作浓度为10mg/mL;所需引物由金斯瑞公司合成,引物序列为:GFPGF:5′GCCGTCTAGAATGAGTAAAGGAGAAGG3′GFPGR:5′GCGCAAGCTTTTATTTGTATAGTTCATG3′.

1.2  菌株LYMCG3 在马尾松体内的扫描电镜(SEM)观察
将菌株LYMCG3在LB液体培养基中于28℃、200r/min摇培24h,4℃条件下10000r/min离心10min后,用PBS缓冲液将菌体浓度调整为105cfu/mL,作为接种剂备用.缓慢将5mLLYMCG3接种剂接种到马尾松组培苗根部,置于组织培养室继续培养.培养7d后,取出组培苗,70%的乙醇冲洗3min,无菌水冲洗6次,用无菌刀片将组培苗的根、茎分别切成0.5~1.5cm,置于Christ/Alpha1G2冷冻干燥机中进行干燥.接着将干燥的样品从内部剖开,粘托后喷金,用NeoScopeJCMG5000台式扫描电镜进行观察.

1.3 gfp 基因标记法检测LYMCG3 在马尾松体内的定殖情况
1)菌株LYMCG3的gfp 基因标记.芽孢杆菌的生物学特性比较特殊,比其他细菌的转化效率低得多.普通制备细菌电转化感受态细胞的方法不适用于芽孢杆菌.试验采用了Xue等[10]建立的利用高渗透法提高芽孢杆菌转化效率的方法(有改进)进行菌株的gfp 标记.
①LYMCG3感受态细胞的制备.
a)接种LYMCG3于5mLLB 培养基中,过夜培养.
b)取2.5 mL 培养菌液接入40 mL 含0.5mol/L 山梨醇的LB培养基中,于28℃、200r/min条件下培养至OD600为0.9左右.
c)将以上摇培菌液冰水浴10min,然后10000r/min、4℃离心5min,收集菌体.
d)用50mL预冷的电转培养基(0.5mol/L山梨醇,0.5 mol/L 甘露醇,10%葡萄糖)重悬菌体,10000r/min、4℃离心5min,去上清,如此反复漂洗3次.
e)将漂洗后的菌体重悬于1mL的电转培养基中,每管60μL分装于EP管.
②带有gfp 基因的质粒向受体菌的转化.a)将50ng质粒DNA(1~8μL)加入到60μL感受态细胞中,冰上孵育2min,加入预冷的电转杯(1mm)中,BTXECM630电穿孔仪电击.电转化参数设置:2.0kV、1mm、电击1次.
b)电击完成后,立即向电转杯中加入1mL 复苏培养基(LB + 0.5 mol/L 山梨醇+0.38 mol/L甘露醇),于28℃、200r/min条件下振荡复苏培养3h,取100μL 涂布含10 mg/mL 四环素的LB 平板.平板置于28℃温箱培养过夜.

③转化子的筛选及鉴定.
挑取转化子筛选平板上的单菌落在含10mg/mL的四环素的LB液体培养基中于28℃、200r/min转速摇培24h.取摇培菌液涂片固定,在ZeissAxioImagerM2荧光显微镜下观察转化子的荧光特性,选择有较高亮度的转化子做进一步鉴定.提取有较高亮度的转化子的质粒,利用gfp 基因特异引物进行PCR 扩增,所得PCR 产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行分离检测.

④转化菌株质粒遗传稳定性测定.
挑取一环LYMCG3转化菌株接种在不含抗生素的LB 液体培养基中,28℃,200r/min振荡培养16~18h作为母液.取50μL母液接入50mL不含抗生素的LB 液体培养基于同样条件下培养12h,接着取以上培养液50μL接种到50mL不含抗生素的LB 液体培养基里培养12h,如此连续接种培养8次,取培养菌液涂布不含抗生素的LB平板,然后从中随机选取200 个单菌落转入含10mg/mL四环素的LB平板,以抗性菌株所占百分比计算标记菌株的遗传稳定性.

2)gfp 基因标记菌株在马尾松体内的激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察. 将标记菌株LYMCG3在LB 液体培养基中于28℃、200r/min摇培24h,4℃条件下10000r/min离心10 min后,用PBS缓冲液将菌体浓度调整为105cfu/mL,作为接种剂备用.取5mL接种液接种到马尾松组69培苗根部,置于组织培养室培养30d取出松苗,用大量无菌水对其进行冲洗;对植株的根、茎进行徒手切片,然后在载玻片上滴1滴无菌水将切片铺展其中,盖上盖玻片,用ZeissLSM710 激光扫描共聚焦显微镜观察,激发波长为481nm.

3)gfp 基因标记菌株在马尾松体内的种群消长动态.将荧光标记LYMCG3菌株在LB液体培养基中于28 ℃、200r/min 摇培24h,4 ℃ 条件下10000r/min离心10min后,用PBS缓冲液将菌体浓度调整为105 cfu/mL,作为接种剂备用.取20mL接种剂缓慢接种到马尾松2年生的盆栽实生苗根表面.并分别于接种后第4、6、9、12、15、20、25、30、40天取根、茎进行内生细菌的分离.称取上述各处理植株样品0.2g,经70%乙醇和0.1%升汞表面消毒后,大量无菌水冲洗3次,样品置于无菌环境下晾干后加1 mL 无菌水进行充分研磨.静置片刻,吸取一定量上清液做10-1、10-

2、10-3 的梯度稀释.然后取100μL 各浓度稀释液涂布于含10μg/mL四环素的LB 平板,各稀释浓度重复3次,28℃培养48h,计算菌落数,统计其定殖情况.

2 结果与分析

2.1 菌株LYMCG3 在马尾松体内的SEM 观察短小芽孢杆菌LYMCG3接种到马尾松组培苗7d后,对其根、茎进行扫描电镜观察.由图1 可知,在马尾松组培苗根表面接种LYMCG3菌株7d后,菌体细胞在松苗根和茎的内部均有分布,说明该菌株具有内生性,能在马尾松体内良好地定殖和传导.

2.2 gfp 基因标记法检测菌株LYMCG3 在马尾松体内的定殖情况

1)菌株LYMCG3的gfp 基因标记.采用高渗透法对菌株LYMCG3进行gfp 基因标记, 通过四环素抗性平板筛选转化子, 用蔡司荧光显微镜对转化子的荧光特性进行检测,选择荧光最强的转化子进行进一步研究. 由图2可以看出,菌体经481nm的蓝光激发后,产生的绿色荧光清晰可见。检测结果表明,gfp 基因在菌株LYMCG3中得到了良好的表达.提取荧光转化子的质粒作为模板,,利用gfp的特异性引物进行扩增。得到了1条约750bp 的清晰条带(图3),与预期的片段大小一致,以上结果说明gfp 基因已转入菌株LYMCG3中。将gfp 基因标记菌株LYMCG3 连续接种培养,检测其遗传稳定性,试验结果表明:标记菌株经过连续8次的稀释培养,其遗传稳定性为96.8%(图4)。芽孢杆菌在适宜的培养条件下分裂1代大约需要30min,,在自然环境下分裂1代则需要50~100h[11],因此,认为构建的工程菌可以用于在马尾松体内的定殖规律研究。您还在用荧光显微镜检测GFP吗?

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3)gfp 基因标记菌株在马尾松实生苗内的种群动态.通过根表面对马尾松盆栽实生苗进行接种,回收试验结果表明,菌株LYMCG3不仅可以有效地在马尾松体内定殖,并能快速地在宿主体内传导,接种后4d在马尾松的根部和茎部都能检测到标记菌株的存在.检测期间,菌株LYMCG3在根、茎的数量总体呈下降的趋势。接种后15d内根部的细菌数量下降趋势快于茎部,之后下降趋势变缓,最后趋于稳定,定殖量达1个数量级.其原因可能是标记菌从马尾松根表面进入根内部后,因其在树体内具有传导性,大部分菌体通过运输系统自地下部分输送到地上部分茎的原因.当标记菌在根、茎内部定殖后,由于其要逐渐适应松苗内部的微环境,故前期菌体大量死亡,数量迅速下降,经过一段时间的适应,菌体数量不再下降,在树体内部开始生存和繁殖,逐渐达到一个稳定水平(图6).总体来看,马尾松茎部的标记菌定殖量高于根部定殖量,可能是茎部环境更适于标记菌的生存和繁殖,这与该菌分离自松树茎部是相对应的.

3 讨论
众所周知,在实验室筛选的具有良好抑制病害的生防微生物,在野外的效果往往并不理想.这其中很重要的一个原因就是生防菌在复杂的野外环境中不能很好地定殖,从而不能发挥功能,这也是一些微生物菌剂释放到田间生防效应年度间浮动大、重复性差的主要原因.有益微生物定殖能力的强弱决定着其应用效果的好坏.目前研究拮抗微生物在植物体内定殖的方法有很多,如免疫学法、抗生素标记法、特异性寡核苷酸片段标记法、基因标记法等。GFP由于不影响目的基因的结构和功能以及细胞的正常培养繁殖,已成为近些年来广泛应用于微生物定殖研究的一种分子标记方法。

并且GFP的表达具有广谱性,目前为止gfp 基因已经在细菌、真菌、植物、鱼类及哺乳动物中进行了表达和应用,还可对标记的活体细胞进行实时定位观察.如任嘉红等,利用GFP标记技术成功观测了溶磷草木樨中华根瘤菌CHW10B在南方红豆杉根际的数量消长动态.安千里等[15]使用激光扫描显微镜完整观察到了GFP标记菌株SA2从水稻根成熟区表面向根内入侵的全过程.笔者所在实验室前期分离到1株对松材线虫具有高拮抗活性的短小芽孢杆菌菌株LYMCG3,采用卡那霉素标记的方法已经初步证明了其内生定殖性.考虑到抗生素标记本身的缺陷。

而且为了更为直观、更精确地揭示菌株LYMCG3的内生现象和内生机制,本研究采用绿色荧光蛋白(GFP)基因标记与激光扫描共聚焦显微镜观察相结合的方法验证了LYMCG3具有内生性,且可以在马尾松体内传导.此外,试验也研究了菌株LYMCG3在马尾松体内的数量动态,接种40d后马尾松体内仍有一定量的标记菌株存在.以上研究结果表明,菌株LYMCG3可以有效地定殖于盆栽马尾松体内,但是菌株能否长期在林间马尾松体内有效定殖还需进一步研究。