PCR过程中的注意事项

2018-06-22 09:48:49 22

PCR过程中的注意事项

多聚酶链式反应即PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制。应用PCR技术可以将微量目的基因(DNA片段)扩增一百万倍以上。因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大,进行比对。

PCR反应理论的提出和技术的完善对于分子生物学的发展具有特殊的意义,它以敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等优点迅速成为分子生物学研究中应用最为广泛的方法之一,并使得很多以往无法解决的分子生物学研究难题得以解决。发明这一技术的K. Mullis因此贡献而获得了1993年度诺贝尔化学奖。

我们都知道PCR反应的成功与否与很多因素关系密切,下面我们就一起探讨一下PCR过程中的注意事项:

 1.引物设计:

PCR反应成功的一个关键条件是正确设计引物。好的引物设计可以避免非特异产物的产生,也极大地影响着扩增产量。当然,有了好的引物,依然需要进行反应条件的优化。然而如果不遵守引物设计的基本规则,即使改变反应条件也不会有什么好效果。

引物设计需要在扩增特异性和扩增效率两方面目标上取得平衡。目前,可利用计算机软件方便地进行引物设计,引物设计软件会通过每一引物设计变化的预定值在两个目标间取得平衡,找出最佳引物。不过,我们也须根据实验具体要求进行适当调整(如在医学诊断中,可以以牺牲效率为代价调整引物以提高特异性,因为在临床诊断中避免假阳性比产生大量扩增产物更重要)。

 2.复性温度:

复性温度是 PCR 扩增是否顺利的关键因素,通常在 50-60℃ 之间。具体的温度主要由引物的 Tm 值决定。延伸温度绝大多数设定为 72℃ 。如果复性的温度很高,可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度,变成二步法 PCR 。

3.反应时间:

 变性步骤一般使用 30 s,如果模板的 G+C 含量较高,或直接用细胞做模板,变性时间可适当延长。复性时间有 30 s一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定,一般采用 1kb 用 1 min来保证充足的时间。

 4.循环次数:

 循环次数主要与模板的起始数量有关,在模板拷贝数为 104~105 数量级时,循环数通常为 25~35 次。

 以上我们可以看出,选择PCR仪的关键之处在于PCR仪能否精确控温,从而保证PCR反应过程的特异性扩增。耶拿公司所有系列PCR仪的温度准确性均能达到± 0.1℃,这对于我们PCR过程是非常有利的。另外,耶拿公司Biometra TAdvanced系列PCR仪具有7大独特性能:高性能智能热盖、升温平均速率快(可达7.0°C/sec)且准确性好、强大的自检功能、超静音技术(不超过45分贝)、高级的用户管理功能、真正的线性梯度功能以及可更换模块。

PCR仪

 

 

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