植物病毒检测方法研究进展

2018-03-08 22:54:42 103

植物病毒检测方法研究进展

植物病毒广泛存在于自然界,因与宿主紧密联系而影响植物的正常生长发育,常常造成农作物减产,甚至导致某种植物物种消亡(范在丰等,2003)。在实际大田生产中,绝大部分植物病毒并没有有效防治的药物(Sera et al., 2017),培育无毒种苗是重要的防治病毒病的方法之一(Rodoni 2009)。脱毒快繁作为植物组织培养应用最多、最广泛和最有效的技术,已经成为培育无毒种苗的重要途径(王秀丽 等,2005)。目前,已有400多种植株建立了脱毒快繁体系,但是如何大规模、高效、快速、经济地检测组培苗是否带毒,一直是制约脱毒技术规模化应用的瓶颈技术,因而成为研究重点。近几年,随着生物技术和信息技术研究的不断深入,植物病毒检测和鉴定技术也不断丰富,方法也变得简便,准确性不断提高,已形成较完整的体系。本文综述植物病毒检测的主要方法,分析其优缺点,以期为组织培养过程中大规模病毒检测和脱毒效果的提供参考。

1 植物病毒检测的历史
植物病毒学家和植物病毒学工作者先后利用生物学、血清学、物理学、化学等多种技术,对植物病毒病进行诊断和和病毒鉴定(孙淼 等,2017)。19世纪30年代,植物病毒的鉴定与分类主要根据寄主范围、症状、体外抗性及介体传播方式等,对生物学性状进行宏观鉴定和病毒分类;19世纪40年代,病毒的物理学特性及血清学技术开始广泛应用到植物病毒的鉴定与分类研究中;19世纪70年代以后,随着分子生物学技术迅速发展,其在植物病毒鉴定与分类中的应用日益广泛;近年来,高通量测序技术和生物信息学的发展,也为病毒的检测和鉴定提供了方便(Robaglia et al., 2006;钱亚娟 等2014)。

2 植物病毒检测方法及其特点
2.1 生物学方法检测
生物学方法检测,也叫外观症状诊断法,主要依据病毒感染植株后的表观症状来识别病毒种类。例如,大蒜感染病毒后会出现植株矮化、叶片扭曲等症状,以此可以用来推断是否感染病毒(陈继峰等,2005)。
侵染植物的病毒种类较多,而且这些病毒往往是复合侵染,不同病毒可在植物上表现相似的症状(邵碧英,2002),造成田间症状表现复杂,有的病毒甚至是不显示症状,不利于观察,所以,外观症状诊断法仅用于病毒病害的初步诊断。
2.2 指示植物鉴别法
指示植物鉴别法,是美国病毒学家霍姆斯(Holmes)在1929年发现的一种植物病毒检测方法。不同病毒往往都有一套鉴别寄主或特定的指示植物,鉴别寄主是指接种某种病毒后能够在叶片等组织上产生典型症状的寄主,指示植物指接种某种病毒后能产生独特症状的一种寄主(董艳娜 等,2016)。根据试验寄主上表现出来的局部或系统症状,可以初步确定病毒的种类和归属。
指示植物鉴定法简单易行、不需要贵重的仪器药品,但工作量大,耗费时间长,灵敏度较低,难以大量检测样本。此外,这个方法还存在以下问题:有些病毒的寄主范围很窄,没有合适的鉴定寄主;不同病毒在同种植物上常产生相同症状;同种病毒的不同株系可产生不同症状;不同土壤和气候条件可改变症状(李春敏 2003)。目前,生物学鉴定已不再作为植物病毒鉴定和分类的主要依据,但可作为其它病毒鉴定方法的一个重要基础。
2.3 电子显微镜检测法
自从Kausche等(1939)首次在电镜下看到TMV以来,电镜已成为植物病毒研究必不可少的常规手段之一。电镜技术已广泛应用于生物学、组织学、细胞学、病毒学等各个领域,是某些病毒最直接、最准确的检测手段(Boonham et al., 2014)。目前的电子显微镜检测技术主要包括电镜负染技术,电镜超薄切片法,免疫吸附电镜技术和扫描电子显微镜检测技术。
利用电镜法鉴定植物病毒的优点是快速、简单和直接,可以直观地观察病毒形态结构以及病毒侵染寄主后引起的细胞超微结构变化,可以较明确的显示超微水平的细胞病理变化。不足之处是电镜价格偏高,操作需要一定技能,而且工作比较集中,样本数量不易太大。按照目前电镜分辨率,以观察到的病毒粒子大小只能判断到科或属,科属以下的分类则无法判定;不同球状病毒的形态大小比较相似,无法用电镜分辨和判定,所以,此方法只能用于实验室少部分样本的检测,无法大量广泛应用。

植物生长灯|LED组培灯|LED花期灯2.4 血清学检测法
血清学方法于20世纪六七十年代发展起来,目前仍是国内外检测植物病毒的常用方法,其原理是利用抗原抗体的体外特异性结合检测植物病毒(Boltovets et al., 2002)。植物病毒的外壳蛋白决定病毒的抗原性,10%-20%的病毒基因组总编码决定外壳蛋白的特定,因这种机制可能导致交叉反应,所以检测结果中会有假阳性和假阴性的情况。在某些情况下,部分植物病毒缺乏外壳蛋白。可以用单克隆抗体技术解决这一问题,能提高检测的准确性和特异性。此外,季节变化的不确定性也阻碍区分阳性与阴性样品(Edwards et al., 1985)。
血清学检测技术主要包括酶联免疫吸附检测法(ELISA 法)、快速免疫滤纸检测法、免疫胶体金检测法、免疫毛细管区带电泳检测法和免疫 PCR检测法。ELISA 方法的最低检测限为 0.1~10ng/mL,具有特异性强、仪器简单、自动化程度高等优点。因此,ELISA 被广泛应用于植物病毒的检测、病毒病的普查、口岸和产地检疫(商明清和魏梅生,2004)。快速免疫滤纸片法(Rapid Immuno-filter Paper Assay,RIPA)制备样品的过程简单,检测样品所需时间短,其灵敏度与间接ELISA 相当。免疫胶体金检测法的优点是简便、快速、直接,不需要酶促反应底物,除试剂外不需任何特殊仪器设备,特别适于田间快速诊断和口岸检疫;缺点是不能准确定量,灵敏度与酶联免疫吸附技术相当(Ríos-Corripio et al., 2016)。免疫毛细管区带电泳检测法灵敏度高,且可快速分析多个样品,因而在无病毒苗木检测、抗病品种选育、植物检疫、种质筛选等方面可发挥重要作用,有广阔的应用前景。免疫 PCR检测法是先用抗体来捕获抗原,提取核酸后,再用 PCR 扩增 DNA 片段,从而放大抗原抗体反应,大大提高了检测灵敏度(Mu et al., 2017)。
2.5 分子生物学检测法
分子生物学检测是以病毒核酸为基础的检测方法,此方法灵敏度高、特异性强、检测速度快。目前,植物病毒检测与鉴定常用的分子生物学方法包括核酸分子杂交技术、dsRNA 电泳技术、多聚酶链式反应技术、实时荧光定量 PCR 技术等。
2.5.1 核酸分子杂交检测法
核酸杂交技术适用于 DNA病毒、RNA 病毒及类病毒的检测,灵敏度高、特异性强,可检测到1pg的DNA,不需要特殊仪器,而且制备好的探针可以包装成试剂盒,易操作,更适用于大量脱毒苗样品的检测(邵碧英 2002)。
2.5.2 双链RNA电泳技术
正常的植物组织中无大分子的 dsRNA,因而可以利用dsRNA 进行 RNA 病毒、类病毒和卫星RNA 的诊断与检测(Blouin et al., 2016)。dsRNA 分析不需要贵重的仪器设备,在一般实验室即可进行。但此方法需要一定的技术和知识才能进行准确诊断,且不适合大量样品和DNA病毒的检测。
2.5.3 聚合酶链式反应检测法
聚合酶链式反应技术(PCR)是Mullis等在 1985 年发明的一种特异性 DNA 体外扩增技术。DNA病毒可以直接进行PCR 扩增,其应用范围不断扩大,特异性和敏感性也不断提高。利用 PCR 对病毒检测的特殊灵敏性,可检测到最低含量为 fg 水平的病毒(Erlich 2015)。
2.5.4 实时荧光定量PCR检测法
RNA 病毒mRNA 含量太低,需先将 mRNA 反转录成 cDNA,再做 PCR 扩增,即可检测特异的 mRNA 或得到其 cDNA 克隆,使其敏感性大大提高。实时荧光定量PCR(RT-PCR)是一种检测 RNA 病毒的行之有效的方法。在植物病毒中 RNA 病毒占 70%以上,所以 RT-PCR 在检测鉴定植物病毒中应用广泛。用 RT-PCR 检测苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎沟病毒的灵敏度可达5pg(Babu et al., 2016)。RT-PCR 不仅可避免假阳性的出现、提高检测灵敏度、实时定量检测,还可采用完全封闭管检测,减少了污染,反应可自动完成,容易定量。
2.6 高通量测序法
Wylie 和 Jones(2012)在对水仙、朱顶红(Hippeastrum)进行病毒检测过程中,在从叶片中提取总 RNA 后,进一步提纯了多腺苷酰化的 RNA 作为模板,利用Illumina HiSeq 2000 平台进行高通量测序,最终获得了麝香石竹潜隐病毒属和马铃薯Y 毒属的7个不同的病毒分离物。Massart(2017)提出了高通量测序检测病毒的概念,Zheng(2017)建立了以small RNAs测序为基础的病毒检测方法。
2.7 其他技术
除上述方法外,目前国内外还采用了分子信标、石英晶体微天平生物传感器、液相色谱-质谱分析法、激光解吸-离子化质谱分析法、核酸斑点杂交技术等较为先进的检测方法检测病毒(Eun et al., 2000;Massart et al., 2017)。其中,Eun(2000) 等应用该技术进行两种兰花病毒的检测。

3 结语
传统生物学法为早期的病毒检测提供了依据;电镜检测法可以观察到病毒颗粒的结构、亚结构、大小和形态组成等细微层面;血清学法操作简便,自动化程度高,反应时间较短,特异性强;分子生物学法检测病毒速度更快,灵敏度更高,导致病毒鉴定方法开始发生本质的变化,研究范围从宏观逐步转移到微观层次。综合考虑检测成本,条件和技术、检测结果要求等因素,具体采用哪种方法,应该根据不同的情况选择。以上每个方法都存在着一些不足,单独使用一种方法都无法达到准确快速、经济可行、灵敏度高的要求,因此,应综合运用多种方法,以核酸分子杂交ELISA和RT-PCR法为主,综合应用电镜检测、传统生物学法方法,可达到植物病毒检测的最佳检测要求和效果。随着植物病毒分类体系的逐步完善,植物病毒鉴定与检测技术的发展将会更快,越来越多的现代检测分析技术将运用到植物病毒鉴定与检测中,为植物病毒病的防治提供可靠的技术保证及科学依据。

文章作者:刘敏1,2,邢晓东1,2,蒋芳玲1,2,吴震1,2*(1 南京农业大学园艺学院,南京 210095; 2 农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,南京 210095)