GFP转染细胞的周期是怎么制样的?

 GFP转染细胞的周期是怎么制样的?

2018-03-11 21:42:54 52

GFP转染细胞的周期是怎么制样的?

转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类:物理介导方法:电穿孔法、显微注射和基因枪;化学介导方法:如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法:有较为原始的原生质体转染,和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法,应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术,是目前转染效率最高的方法,同时具有细胞毒性很低的优势。但是,病毒转染方法的准备程序复杂,常常对细胞类型有很强的选择性,在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法,则各有其特点。需要指出的一点,无论采用哪种转染技术,要获得最优的转染结果,可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多,从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节。


为了使PI染色能够取得更好的效果,细胞通常需要用乙醇破膜,以使PI能够进入到核内。然而,用乙醇处理后,容易导致胞内可溶性的GFP在破膜后漏出,从而使GFP荧光降低或缺失。用固定剂(如多聚甲醛)虽然可以保留住细胞内的GFP,但是容易导致G0/G1峰的CV系数过大,可通过先固定、再破膜的方法,即先用1%多聚甲醛固定,然后用70%乙醇破膜,最后用含RNAse的PI染液染色。

但是,一定要设置好两个对照:
(1) GFP转染的细胞,不加PI;
(2)未转染GFP,未加药的细胞,加PI。

具体有哪些步骤?
•计数细胞
•往流式管中加入1×10E6细胞,PBS洗涤一次(300×g离心5分钟,4℃)
•用多聚甲醛固定细胞:去上清,加入500 μl 冷PBS,轻柔混匀。加入500 μl冷(4°C)固定液,再次混匀。4℃孵育1小时。
•不同种类的细胞,需要不同浓度的多聚甲醛,以获得最佳的保留GFP的效果、获得较好的CV值。
•乙醇破膜:300×g离心5分钟(4℃),去上清,再次用3ml冷PBS洗涤1次。逐滴加入1ml 70%的乙醇(-20℃),边加边振荡混匀,4℃孵育过夜。
•注意,多聚甲醛固定之后,细胞可能分散在管底,肉眼很难看见。加入乙醇时,振荡动作需要轻柔,乙醇孵育至少2小时以上。
• PI染色: 300×g离心5分钟(4℃),去上清,加入1ml PI工作液,常温孵育30分钟。
• 过滤,上机分析。

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转染操作流程(以常用的 6 孔板为例)

 (1) 细胞培养: 取 6 孔培养板,以 3x10 4 /cm 2 密度铺板, 37 ℃ 5%CO 2 培养箱中培养至 70% ~ 90% 汇合。 ( 不 同细胞略有不同,根据实验室优化的条件进行,汇合过分,转染后不利筛选细胞 ) 。

(2) 转染液制备: 在 EP 管中制备以下两液 ( 为转染每一个孔细胞所用的量 ) A 液:用不含血清培养基稀释 1- 10μg DNA ,终量 100μL , B 液:用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂,终量 100μL ; 轻轻混合 A 、 B 液( 1:1 混匀) ,室温中置 15 分钟,稍后会出现微浊现象,但并不妨碍转染。

 (3) 转染准备:用 2mL 不含血清培养液漂洗两次,再加入 2mL 不含血清及 PS 的培养液。

 (4) 转染:把 A/B 复合物缓缓加入培养液中(缓慢滴加) ,轻轻摇匀, 37 ℃温箱置 6 ~ 8 小时,吸除 无血清转染液,换入正常培养液继续培养。

蛋白表达和培养基的选择

哺乳动物细胞系合成可溶的,翻译后修饰的蛋白,比细菌,真菌或昆虫细胞中表达的蛋白更有 可能有生物活性。稳定转染的细胞可以合成大量的重组蛋白,而瞬时转染细胞可以快速表达,迅速 地合成小量蛋白。常用的细胞系包括 CHO , 293 和 COS-7 。 Invitrogen 提供克隆的 293-F , 293-H , COS-7 和 CHO-S 细胞, 来源于经筛选转染效率更高的亚细胞系。 这些细胞也可用于无血清和限定化 学成分培养基。重组蛋白的大规模生产一般在稳定转染的悬浮细胞中进行。这些细胞易于生长到高 密度并合成更多蛋白。使用基质珠做为固相支持可以使贴壁细胞悬浮生长。用于蛋白生产的细胞的 转染可以在添加有血清或无血清培养基中进行。但更倾向于使用无血清培养基表达蛋白,因为血清 蛋白会干扰下游表达蛋白的纯化。无血清培养基一般针对某一特定细胞类型优化并有几类无血清培 养基不需要添加血清,一般含有不均一的或大量的蛋白(但比添加血清的培养基低得多) 。无蛋白培 养基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物。 限定化学成分的培养基不含有蛋白或未知组成的成分。 多种多样的配方使您可以选择最适合您应用的一种。 在含血清时转染的细胞可以适应无血清培养基, 无蛋白培养基或限定化学成分的培养基。在部分情况下(如 293-F , 293-H , COS-7 和 CHO-S ) ,对 于已适应无血清或无蛋白培养基的细胞,可以使用其培养基进行转染(图 18 ) 。其他一些无血清培 养基包含抑制阴离子脂质体介导转染的成分。在这些情况下,有必要在诸如 D-MEM 或 OPTI-MEM Ⅰ等培养基中进行培养和转染。