绿色荧光蛋白GFP细胞的分选方法和相关文献

2018-05-29 15:43:00 60

绿色荧光蛋白GFP细胞的分选方法和相关文献

研究背景
绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)是一种能够自身催化形成发色结构,并在488nm激发光源激发下发出绿色荧光的报告基因,GFP的发现及其研究发展迅速,使得人们能够在正常生活条件下对活细胞内分子水平上进行的各种过程及其分子机理进行观察和研究,研究表明,GFP能在多种生物,如细菌、酵母、植物及哺乳动物中表达且产生可见荧光,因此有着很高的应用价值。

建立瞬时或稳定表达细胞株是研究基因功能的重要手段。用带GFP(绿色荧光蛋白)标记的质粒转染细胞,在488nm激光激发下,表达GFP的细胞发绿色荧光,这样可以很方便的跟踪目标基因,也为用流式细胞分选技术获得高纯度的转染细胞株提供了捷径。

实验案例
本实验为U937细胞转染GFP和目的基因(徐州医学院),用BD FACSAria III分选高表达GFP目的基因的细胞。同时该单位还拥有全球最高端流式细胞分选系统Influx,并且配备了7激光,可实现24参数同时检测。
植物生长灯|LED组培灯|LED花期灯

结果讨论
GFP分选是现在流式细胞分选比较多的实验,作为单参数分选实验,GFP分选相对比较容易,但由于很多时候GFP转染效率很低,GFP阳性细胞分选实验就变成了低含量目的细胞分选实验,大部分GFP阳性细胞分选后都是为了后续继续培养,因此分选活性和分选达到一定数目目的细胞尤为重要,低含量目的细胞的分选高活性的保证除了仪器设计对细胞活性的保护外,还要求分选时间不宜过长,因此还要求分选速度要快,要在尽可能短的时间获得尽可能多的细胞数,达到后续培养的要求。

本案例用BD FACSAria III分选GFP阳性细胞,该样本GFP阳性的目标细胞含量仅为1.9%,分选后回测,目的细胞纯度高达99%,高纯度的分选得益于BD FACSAria III将液滴进行32等分的高精度分析和BD专利Accudrop技术带来的液滴充电时间(Drop delay)的高精准,分选后细胞在显微镜白光视野下可见,细胞膜清晰,状态很好,在荧光显微镜下GFP所发绿光清晰可见,充分说明FACSAria III分选低表达细胞的高纯度和高活性。

相关文献
简介:这篇文章将GFP分选和SP分选结合起来,证明了小鼠骨髓造血干细胞一定会表达Abcg2转运蛋白,并认为Abcg2有望成为造血干细胞富集的特异性标志。为了研究Abcg2的表达、SP分型以及造血干细胞之间的相互关系,研究人员将GFP基因插入Abcg2基因得到基因改造小鼠,在这些小鼠中,大多数的骨髓细胞都表达Abcg2/GFP, 且10% Lin- 细胞和91% SP细胞也都表达Abcg2/GFP,研究人员将各种Abcg2/GFP+骨髓细胞群用FACS Aria 进行活细胞分选并移植入小鼠体内以检测造血能力,结果发现Lin-/GFP+细胞显著的富集了造血干细胞,而Lin-/GFP+细胞无任何再造血能力,植入分选出的Lin-/GFP+细胞仅10个,7只小鼠中也有1只具再造血能力,植入60个有50%的成功率,而植入125个以上基本实现100%的成功率,充分说明了BD FACSAria 细胞分选的高活性。