快速观察到动植物体内的GFP荧光蛋白表达位置

如何快速观察植入到动植物体内的荧光蛋白?

2018-05-29 15:34:48 57

观察GFP荧光蛋白有哪些方法?

 绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)是一类存在于腔肠动物体内的生物发光蛋白。GFP具有多种优点:易于检测,灵敏度高;荧光性质稳定,耐受性强;易于表达,无细胞毒性;可用于活细胞检测。因此,GFP可作为报告基因用于检测基因表达或调控,或作为融合标签来检测蛋白质分子的定位、迁移、构象变化以及分子间的相互作用,或者靶向标记某些细胞器。

GFP吸收的光谱最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副吸收峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder)。虽然450~490nm只是GFP的副吸收峰,但由于该激发光对细胞的伤害更小,因此通常多使用该波段光源(多为488nm)。此外,GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,两者通常共有一套滤光片。GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素强,特别是在450~490nm蓝光波长下更稳定。

类似的,GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。由于GFP荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白,比如萤火虫荧光素酶等。


观察GFP荧光蛋白方法有:


1.便携式GFP激发光源:

采用便携式GFP激发光源(又叫荧光蛋白观测镜)是最便捷、最方便的观察方法,因GFP在470nm有一个很高的吸收峰,采用470nm激发光源能够激发GFP发出明亮的绿色荧光,在观察gfp荧光时,因为激发光为强烈的蓝色光线,必须佩戴专业的观察眼镜才能观察到清晰的荧光信号。推荐使用美国路阳LUYOR-3260便携式激发光源。

采用便携式GFP激发光源观察到的效果

上图为采用便携式GFP激发光源观察到的效果


2. 紫外光源:

采用紫外光源(又叫紫外线灯、黑光灯)观察也非常方便,但如果观察植物,植物叶片的叶绿色在紫外线灯下也会发出荧光,对gfp发出的荧光也会产生干扰,另外,标本长时间在紫外光源照射下对GFP标本组织也会造成破坏。

 紫外线灯照射含有GFP叶片的效果

上图为紫外线灯照射含有GFP叶片的效果。


3.荧光显微镜

 荧光显微镜(Fluorescence microscope) : 荧光显微镜是以紫外线为光源,用以照射被检物体,使之发出荧光,然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发荧光,荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。目前在常用的方法就是采用荧光显微镜观察,荧光显微镜在实验室非常普及,但唯一的不足是必须采集叶片或动物切片进行观察,对培养的标本进行破坏,无法进行活体观察。

荧光显微镜观察GFP的效果

上图为荧光显微镜观察GFP的效果。

综合分析,采用采用便携式GFP激发光源(又叫转基因生物观测镜)是观察荧光蛋白GFP最便捷、最方便的方法.